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酵母表面展示(yeast surface display, YSD)是一种广泛使用的细胞表面展示技术。酵母表面展示技术将目的蛋白展示在细胞表面，并赋予酵母宿主新的能力，与流式细胞分选相结合，该技术既可用于定量检测目的蛋白的平衡结合常数、解离动力学性质，也可用于提高目的蛋白稳定性和特异性，节省了烦琐的纯化步骤[1]。酵母展示技术在生物技术、工业以及农业领域得到广泛应用，有助于实现人类社会可持续发展。 1 酵母展示系统概述 酵母细胞是最成熟的真核表达宿主之一，作为一种优良的细胞表面展示微生物，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)和多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)已经在酵母表面展示技术中应用，它们分别利用特定的锚定蛋白将目的蛋白靶向并定位到酵母细胞表面[2]，本文对现有酵母展示系统进行总结，包括所使用的酵母菌株、锚定蛋白、启动子和其构建策略等(表 1)。目前，S. cerevisiae、P. pastoris和Y. lipolytica已获得美国食品和药品管理局(US Food and Drug Administration, FDA)安全认证[1]。 1.1 凝集素系统 酵母展示凝集素系统包括a-凝集素系统和α-凝集素系统。a-凝集素系统由Aga1p和Aga2p两个亚单位组成，通常将目的蛋白与Aga2p的羧基端融合，Aga2p与Aga1p通过二硫键形成复合物，同时Aga1p通过β-1,6-葡聚糖共价键锚定在S. cerevisiae酵母细胞壁上，从而使目的蛋白展示在酵母表面；构建表达载体时通常包含2个表位标签，位于目的蛋白的N端和C端，如图 1A所示，分别是血凝素(hemagglutinin, HA)标签和C-myc标签，允许同时检测配体结合和酵母表面目的蛋白表达水平(图 1B)[21]。而α-凝集素系统只含有一个锚定单位Agα1，通常将目的蛋白与Agα1的氨基端融合[22]。 1.2 絮凝素系统 酵母絮凝素蛋白Flo1p是酵母细胞壁上的凝集素样蛋白，由FLO1基因编码。Flo1p由4个结构域组成，包括分泌信号结构域、絮凝功能结构域(flocculation functional domain, FFD)、糖基磷脂酰肌醇(glycosylphosphatidylinositol, GPI)锚定附着信号结构域和膜锚定结构域，其中FFD可以识别和非共价结合细胞壁成分。絮凝素系统可以通过2种方式锚定目的蛋白，既可以通过Flo1p羧基端的GPI附着信号与细胞壁结合，在氨基端展示目的蛋白(图 2A)，又可以通过Flo1p氨基端的FFD与细胞壁结合，在羧基端展示目的蛋白(图 2B)[22]。 2 酵母展示文库的构建及应用 酵母展示文库的产生通常依赖于前体蛋白的随机突变，突变一般通过易错PCR获得，将产生的目的基因突变文库与载体酶切产物同时转化感受态酵母细胞，细胞内突变基因和载体序列发生同源重组，从而制备大小约为107‒109的酵母展示蛋白质突变文库[23]。 2.1 cDNA文库 Boder等[24]首先发现单链抗体片段能够展示在S. cerevisiae表面，易于被大分子识别，并发现酵母展示技术非常适合用于构建抗体文库和文库筛选。酵母展示系统可在体外实现抗体亲和力成熟，弥补了噬菌体展示、细菌表面展示和酵母双杂交等技术的不足。酵母双杂交系统局限于依赖“诱饵”和“猎物”融合蛋白在内部的共同表达，不能用于鉴定外部合成或修饰的蛋白质或化合物的配体[25]。Bidlingmaier等[25-26]构建了一个更大的酵母表面展示人类cDNA文库，筛选得到可与磷酸酪氨酸肽特异性结合并且含有SH2结构域的蛋白质配体；同时发现人类cDNA文库可以在S. cerevisiae表面正确折叠且行使正常功能，证实功能性人类蛋白质片段的大型文库可以成功展示在酵母表面，可用于鉴定药物靶点和寻找小分子或药物交叉反应蛋白；结合荧光激活细胞分选(fluorescence-activated cell sorting, FACS)，使用荧光标记的可溶性分子筛选其配体；也可用于筛选新的具有酶活性的细胞蛋白。 此外，酵母表面展示的人类cDNA文库可以用于鉴定药物作用靶点，例如Bidlingmaier等[27]证实S. cerevisiae酵母表面展示人类cDNA文库结合荧光激活细胞分选，可以筛选出能够与小分子相互作用的蛋白质，后来又成功用于快速鉴定间皮瘤的一种靶抗原黑色素瘤细胞粘附分子(melanoma cell adhesion molecule, MCAM)，为鉴定肿瘤细胞表面靶点提供了一种新的方法。最近，有研究人员构建了一种定量的S. cerevisiae酵母双杂交系统(quantiative yeast-yeast two hybrid, qYY2H)，既可以通过筛选cDNA文库以鉴定蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein interaction, PPIs)，还可以对诱饵-猎物结合的亲和力进行定量[28]。 通过构建酵母展示SARS-CoV-2刺突蛋白受体结合结构域(receptor-binding domain, RBD)突变文库，结合FACS进行深度抗原突变筛选，可快速鉴定所有影响中和性抗体结合RBD的单氨基酸突变[29]。考虑到FACS筛选突变文库受到低通量的限制，Cao等[30]基于酵母展示技术建立一种中和性抗体表位高通量鉴定的方法，该方法利用磁珠激活细胞分选(magnetic-activated cell sorting, MACS)将通量提高了2个数量级。该研究在RBD中鉴定出247种免疫逃逸突变谱，这些突变将影响中和性抗体结合RBD，并发现感染SARS-CoV-2 B.1.1.529 (Omicron)将导致强烈的体液免疫逃逸，证实针对沙贝病毒(Sarbecvirus)保守区的中和性抗体是最有效的，该研究为Omicron和新冠变异株的抗体药物以及疫苗的开发提供了依据[30]。 2.2 pMHC文库 抗原提呈细胞(antigen presenting cell, APC)摄取抗原并对抗原进行加工处理，产生的抗原肽与主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex, MHC) Ⅰ类和Ⅱ类分子结合，递呈在APC表面，供T细胞受体(T cell receptor, TCR)识别，其中抗原肽-MHC (peptide-major histocompatibility complex, pMHC)与TCR之间相互作用对于启动适应性免疫应答至关重要，在移植、感染、疫苗接种和自身免疫过程中发挥重要作用[31]。Sibener等[32]利用S. cerevisiae酵母展示pMHC文库成功鉴定无反应TCR的肽激动剂，阐明了体内发生的非激动性高亲和力TCR-肽-MHC相互作用的分子机制，同时发现酵母展示pMHC文库中TCR配体的生物物理特性，其中激动剂和非激动剂之间最小差异仅为一个亚甲基。Gee等[33]使用S. cerevisiae酵母展示pHLA文库，在人类大肠腺癌中筛选肿瘤浸润淋巴细胞(tumor-infiltrating lymphocyte, TIL)表面表达的“孤儿” TCR的抗原，发现TCR可以特异性识别具有同源性的抗原，此方法有助于无偏倚筛选肿瘤抗原。 本课题组近期开发一种在蛋白质抗原中快速鉴定MHC-Ⅱ配体(rapid identification of peptide ligands from protein antigens, RIPPA)的方法，将人类MHC-Ⅱ等位基因(HLA-DR4)以天然非共价α链、β链二聚体的形式展示在 S. cerevisiae细胞表面，使用GAL1-10双向启动子引导α链和β链的表达，而Fos/Jun亮氨酸拉链(leucine zipper, LZ)二聚化基序可以促进α链与β链配对，有助于提高酵母表面HLA-DR4表达水平；如图 3所示，融合抗原肽或者空载的DR4通过Aga2p和Aga1p锚定在酵母细胞表面，通过流式细胞术可检测目的蛋白表达水平，箭头所示是可用于抗体染色的蛋白质或表位标签，酵母细胞表面展示HLA-DQ6采用与此相似的方式；本课题组基于酵母表面展示技术，利用空载的MHC-Ⅱ建立一种快速抗原表位鉴定方法，结合流式细胞术从发作性睡病自身抗原下丘脑泌素(hypocretin, HCRT)中鉴定DQ6配体，并使用SARS-CoV-2刺突蛋白作为模型抗原，进一步验证RIPPA可以快速鉴定MHC-Ⅱ抗原肽配体，RIPPA为MHC-肽-TCR相互作用的深入研究奠定了基础[34-35]。 Rappazzo等[36]基于S. cerevisiae酵母展示技术建立一种高通量鉴定MHC结合肽的方法，然后构建包含SARS-CoV-2蛋白质组的抗原肽文库，在蛋白组中鉴定MHC结合肽；为了验证该方法，该研究随后在4种登革热病毒血清型组成的抗原肽文库中鉴定MHC-Ⅱ结合的抗原肽；进一步证实该方法可以从病毒蛋白组中鉴定潜在的抗原肽，在确定肽-MHC结合相互作用方面发挥重要作用[37]。 3 酵母展示技术在抗体工程中的应用 抗体广泛应用于基础研究、诊断、治疗和公共卫生等领域，其亲和力对于特异性识别生物分子非常重要[38]。早期利用动物免疫制备抗体，存在很多缺陷，时间长、成本高且不易获取、对自身抗原的耐受性不高以及涉及科学和伦理问题等[38-39]。相比噬菌体展示技术，酵母展示技术更适合抗体文库的构建以及抗体片段的筛选，它可以区分亲和力相差2倍的蛋白质，说明酵母展示技术具有较高的敏感性[40]。 3.1 抗体亲和力成熟 特定抗体制备通常需要使用抗体工程化改造，YSD可以满足这一要求[41-42]。Sun等[43]从S. cerevisiae酵母表面展示IL-17A抗体的随机突变文库中筛选出高亲和力的抗体8D3，然后将其互补决定区移植至HuFv4D5的稳定框架上，最终得到的杂交抗体9NT/S具有更高的稳定性和亲和力，并可有效抑制致炎细胞因子诱导的IL-17A分泌。Keck等[44]利用简化的单链抗体组装方法，创建改良的YSD载体，减少PCR错配引起的碱基交换，通过中和试验筛选活化B细胞上清，富集分泌丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)单抗的B细胞，最终成功从丙型肝炎病毒感染者中分离得到高亲和力的HCV中和性单抗。以鸡作为宿主制备高亲和力单抗可以克服很多哺乳动物对保守表位产生免疫的缺陷，Bogen等[45]基于FACS建立一种S. cerevisiae酵母展示技术平台，用于分离高亲和力抗体，并利用该平台分离和鉴定一种结合表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)的特异性抗体FEB4，进一步利用基于表位结合的新筛选方法分离出更高亲和力的抗体SEB7，其亲和力比FEB4高近30倍[46]。Elter等[46]从免疫鸡中分离出EGFR胞外结构域的高亲和力抗体，将其互补决定区移植到人源抗体框架上，构建S. cerevisiae酵母展示抗体文库，筛选获得scFv和Fab类的高亲和力抗体，经过人源化改造，与亲代鸡抗体相比，使人源化抗体变体具有更高的亲和力和改善的蛋白质特性。近年来单链可变区片段(single-chain fragment variable, scFv)抗体筛选已成为开发疾病有效疗法的重要工具[47]，Lajoie等[48]用功能性S. cerevisiae酵母展示免疫沉淀(functional yeast display immunoprecipitation, fYDIP)方法在血脑屏障(blood-brain barrier, BBB)细胞膜裂解液中筛选scFv，成功筛选出能够与含衔接蛋白2 (adaptin 2, AP-2)的蛋白复合物结合的抗体分子。 3.2 酵母展示抗体Fab片段 van den Beucken等[49]使用pYD1酵母展示载体构建抗体Fab片段表达质粒pTQ3，该重组质粒允许可溶性轻链和重链串联表达，并与锚定蛋白Aga2p融合表达在S. cerevisiae表面，结合随机突变构建Fab抗体文库，经过一轮随机突变和FACS筛选，多价抗原链霉亲和素的抗体特异性提高了10.7倍。酵母展示技术是人抗体片段亲和力成熟的强大工具，但受到酵母展示文库大小的限制，Blaise等[50]分别构建了重链表达质粒pTQ5-HC和轻链表达质粒pTQ6-LC，转化S. cerevisiae EBY100和BJ5457，2种菌株在一定条件下交配得到酵母展示人源Fab抗体库，文库大小达到109，进一步使用易错PCR可将文库大小提高到5×109。Rosowski等[51]将抗体重链和轻链编码基因构建在一个表达载体上，获得S. cerevisiae酵母表面展示Fab抗体库，相比酵母交配，该方法可以减少构建文库所需要的时间和成本，并且易于构建文库大小108以上的大型抗体展示文库，便于筛选获得高亲和力的抗体[52]。 3.3 酵母展示VHH单域抗体 酵母表面展示文库也可用于筛选单域抗体，例如Roth等[53]将S. cerevisiae酵母表面展示重链单域抗体(variable domain of the heavy chain of heavy-chain antibody, VHH)文库与FACS相结合筛选出具有抗原特异性的VHH单域抗体。纳米抗体是一种无轻链的功能性抗体，已在临床诊断中得到广泛应用，VHH结构域有显著的抗体特异性，能够作为治疗药物[54]。一些研究者将纳米抗体文库编码序列与S. cerevisiae酵母α-凝集素基因的C端结合，并在P. pastoris表面表达[2]。直到2018年McMahon等[55]基于 S. cerevisiae酵母展示技术开发一种体外纳米抗体文库平台，该平台使用结构已经解析的纳米抗体序列设计文库，结合FACS可以直接、快速地筛选能够特异性结合人类G蛋白偶联受体的纳米抗体，现有的纳米抗体几乎都是免疫动物获得的，成为限制纳米抗体应用的瓶颈。不同于以往，该平台将纳米抗体基因融合到Aga2p的氨基端，除用于纳米抗体免疫文库筛选，还能通过正交标记检测酵母展示水平，并便于对配体进行初步的生物物理和生化性质鉴定[54]。 4 酵母展示技术在蛋白质工程中的应用 4.1 提高蛋白质的亲和力 酵母表面展示是一种强大的蛋白质工程技术，广泛用于提高蛋白质的各种特性，包括亲和力、特异性和稳定性[21]。酵母展示技术可以区分亲和力只有2倍差异的蛋白质，具有较高的敏感性，已经成为蛋白质亲和力成熟的重要工具。如图 4所示，一般通过随机突变创建大小为107−109的蛋白质突变文库，转化S. cerevisiae EBY100，这些突变体与Aga2p融合展示在酵母表面；在FACS分选之前，将突变文库与饱和浓度的荧光标记配体一起孵育，通过洗涤去除未结合的配体，然后将文库与100倍未标记配体孵育，或者在足够体积的缓冲液中孵育，从而避免解离后荧光标记配体再结合；进一步使用FACS分选高亲和力突变体，每一轮分选的细胞可以扩增培养参与再次分选，从而降低文库多样性，最终获得少量的高亲和力酵母细胞克隆；也可以提取所选酵母细胞DNA，进行新一轮随机突变，构建新的展示文库，参与新一轮分选，直到筛选出所需亲和力的蛋白质[23]。 基于酵母展示技术提高蛋白质亲和力应用非常广泛。FK506结合蛋白51 (FK506-binding protein 51, FKBP51)是应激相关障碍的潜在靶点，Lerma Romero等[56]对FKBP51编码序列的FK1结构域进行随机诱变和位点饱和诱变，构建S. cerevisiae酵母表面展示FKBP51突变文库，使用构象特异性荧光标记配体染色，利用FACS分选高亲和力FKBP51变体，鉴定出15种不同亲和力蛋白突变体，与野生型相比亲和力提高了34倍。van Rosmalen等[57]通过S. cerevisiae酵母展示技术和深度突变扫描，将中间位(meditope)肽对西妥昔单抗的亲和力提高了10倍，该方法广泛应用于开发对治疗性抗体具有低亲和力的中间位肽。Jeong等[58]将单链胰岛素类似物SCI-57展示在S. cerevisiae DY1632表面，SCI-57能够正确折叠，并且仍保持对胰岛素受体的亲和力，此方法可以用于构建胰岛素样肽文库，以便筛选化学探针或治疗分子。 消旋胰蛋白酶是一种参与肿瘤进展的蛋白酶，与肿瘤的生长和许多癌症的进展及不良预后密切相关，有效的消旋胰蛋白酶抑制剂可以为侵袭转移性癌症患者的治疗提供希望，但是，消旋胰蛋白酶作为底物，往往裂解和灭活许多蛋白酶抑制剂，成为制备抑制剂的巨大挑战。研究发现，在天然丝氨酸蛋白酶抑制剂中，Kunitz结构域家族有助于抵抗消旋胰蛋白酶裂解。Cohen等[59]使用S. cerevisiae酵母展示平台，对人淀粉样前体蛋白(amyloid precursor proteins, APPI) Kunitz结构域进行定向进化，最终筛选得到三位点突变体APPIM17G/I18F/F34V，相比野生型APPI，该突变体与消旋胰蛋白酶的亲和力提高1 459倍，蛋白水解稳定性提高83倍，从而获得更好的抗癌蛋白抑制剂。之后Sananes等[60]基于S. cerevisiae酵母展示技术构建APPI突变体文库，通过流式细胞术筛选工程化KLK6抑制剂，得到一种APPI突变体，即APPIM17L、I18F、S19F、F34V (APPI-4M)，与野生型APPI相比，其亲和力提高了146倍，蛋白水解稳定性提高了13倍，APPI-4M未来有望用于临床显像和肿瘤治疗。 4.2 提高蛋白质稳定性 蛋白质稳定性通常是指其抵抗热变性、化学变性以及蛋白质降解的能力。酵母展示技术筛选高稳定性的蛋白质可以采取2种策略，第一种策略基于酵母表面适当折叠蛋白质表达水平与其热稳定性之间的相关性，酵母表面高表达的蛋白突变体，其稳定性也高；第二种策略是在细胞分选之前，选择合适的温度和时间对酵母展示文库进行热激处理，结合FACS筛选出耐热变性的突变体，既可以参与新一轮的筛选，也可以定向进化构建新一轮的酵母展示文库，以此循环筛选出具有热稳定性的突变体[61]。 高稳定性对于蛋白质的广泛应用非常重要。Laurent等[62]使用野生型的可溶性CD19胞外结构域(extracellular domain, ECD)基因通过PCR错配构建S. cerevisiae酵母展示CD19-ECD文库，然后分别使用CD19-ECD构象特异性抗体FMC63和c-myc抗体染色，通过FACS筛选CD19-ECD突变文库，成功获得高稳定性的CD19-ECD突变体SF05，有望用于B细胞免疫学检测和靶向CD-19肿瘤免疫治疗。木质素过氧化物酶(lignin peroxidase, LiP)是一种含血红素的氧化还原酶，具有氧化多种污染物的能力，为了提高其氧化稳定性，Ilić Durdic等[63]基于S. cerevisiae酵母展示技术构建LiP随机突变文库，结合流式细胞术筛选高活性LiP突变体，通过2轮分选，得到具有较高氧化稳定性的LiP突变体，其活性不随时间延长而显著降低，非常适合生物修复和工业应用。 4.3 T细胞受体工程化改造 此外，Lee等[64]基于S. cerevisiae酵母展示技术对T细胞受体样抗体H9进行工程化改造，提高抗体亲和力。H9特异性识别人类巨细胞病毒(cytomegalovirus, CMV) pp65蛋白衍生肽与HLA-A*02:01 (CMVpp65495-503/HLA-A*02:01)复合物，通过酵母表面展示技术对H9的重链(variable region of heavy chain, VH)和轻链(variable region of light chain, VL)可变区的第三互补决定区(VH-CDR3/VL-CDR3)进行随机突变得到酵母展示H9文库，经过3轮筛选得到较高亲和力的C1 (scFab)；为了进一步提高抗体C1的亲和力和特异性，随后再次通过酵母展示技术对C1的VH-CDR2/VL-CDR2进行随机突变构建酵母展示C1文库，经过4轮筛选最终得到高亲和力抗体C1-17，其亲和力是亲本H9的67倍，可用于检测和治疗CMV感染。 5 酵母展示技术在酶工程中的应用 5.1 酶的定向进化及其工业应用 人工定向进化是改变酶原有性质、产生新型高效酶的重要手段，已被用于生产高活性和强特异性的酶[65]。酵母展示技术结合同源重组和文库筛选已经实现酶的人工定向进化，目前有多种酶成功展示在酵母细胞表面(表 2)。米黑根毛霉脂肪酶(Rhizomucor Miehei Lipase, RML)是一种生物催化剂，可用于食品工业、精细化工和生物柴油生产，将经过定点突变的米黑根毛霉脂肪酶与Flo1p结合并展示在P. pastoris表面，得到的突变体的酯化活性是原始脂肪酶活性的1‒5倍，酵母展示技术允许高效快速筛选高酯化活性脂肪酶突变体[66]，同时避免纯化和固定化过程，但宿主细胞自身蛋白酶可能影响酵母表面展示的脂肪酶活性。最近有研究使用自身蛋白酶缺陷的P. pastoris表达系统，其表面展示的RML活性比野生型酵母高出46.7%，更利于工业应用[67]。抗坏血酸过氧化物酶(engineered ascorbate peroxidase, APEX)是一种工程过氧化物酶，参与多种底物的氧化过程，Han等[71]开发了一种进化的分裂APEX2 (sAPEX)系统，通过S. cerevisiae酵母展示系统进行定向进化，使APEX2在重组过程中保持较高过氧化物酶活性，未来可应用到生物学研究的新领域。研究发现，在不影响发酵性能的情况下，S. cerevisiae酵母表面展示的α-乙酰乳酸脱羧酶(α-acetolactate decarboxylase, ALDC)可以生产出更有味道的酒精饮料；酵母表面展示β-葡萄糖苷酶可以增加饮料的香气和风味[10, 72]。 5.2 酵母全细胞生物催化系统 有机磷水解酶(organophosphorus hydrolase, OPH)能够有效水解多种有机磷酸酯，减少污染，将OPH锚定在S. cerevisiae MT8-1表面，其水解活性增高，不仅可以成功水解神经毒药物，还可快速检测出有机磷中毒[73]。为了进一步快速准确地检测有机磷农药，Liang等[74]基于S. cerevisiae酵母展示技术构建了乙酰胆碱酯酶的全细胞酵母生物催化剂。对羟基苯甲酸酯是新兴的环境污染物，Zhu等[75]将茄皮镰刀菌角质酶(Fusarium solani pisi cutinase, FsC)展示在S. cerevisiae表面，开发了一种全新的生物催化剂SDFsC，该研究首次使用酶法去除对羟基苯甲酸酯。聚对苯二甲酸乙二醇酯(polyethylene terephthalate, PET)也是广泛使用的塑料品之一，将聚对苯二甲酸乙二醇酯降解酶(PETase)展示在P. pastoris表面，可以提高此酶对PET的降解效率，而且酵母全细胞生物催化剂转化率比可溶性的PETase高约36倍，在重复使用7次之后，得到的全细胞生物催化剂拥有稳定的周转率[68]。β-烟酰胺单核苷酸(β-nicotinamide mononucleotide, β-NMN)是一种天然存在的生物活性核苷酸，在新陈代谢、衰老、细胞死亡、DNA修复和基因表达等生命过程中发挥重要作用[76]。烟酰胺核糖激酶2 (nicotinamide riboside kinase 2, NRK-2)可以一步法催化烟酰胺核糖(nicotinamide riboside, NR)转化为β-NMN，He等[77]将NRK-2展示在S. cerevisiae EBY100细胞表面，成功获得高pH稳定性和热稳定性的全细胞NRK-2催化剂，以此催化NR合成β-NMN，其转化率高达98.2%，远高于原有合成工艺，在工业生产中有巨大的应用价值。 5.3 酵母多酶共展示体系 在生物转化和污染物降解的过程中，一般有连续的级联反应，通常需要多种酶的参与，因此开发工程酵母生物催化剂，可以同时展示多种酶，将多个反应整合到一个体系中，在乙醇的生产、生物降解或污染物的生物处理中得到广泛应用[78]。Bae等[79]发现，S. cerevisiae表面可以同时展示3种不同的纤维素酶，其降解活性是单一酶的2倍。在此基础上，Chen等[80]建立了糖化与发酵联合生物处理(consolidated bioprocessing, CBP)体系，该体系由2种S. cerevisiae工程菌株Y5/XynII XylA (同时展示2种木聚糖酶)和Y5/EG-CBH-BGL (同时展示3种纤维素酶)组成，木聚糖酶(xylanase, XYN)作为一种辅助酶，可以改变纤维素纤维的物理特性，帮助纤维素酶更有效地接近纤维素底物，从而加速底物水解。Guirimand等[81]通过在S. cerevisiae工程菌株(YPH499-XR41-BGL-XYL-XYN)表面展示3种酶，包括细胞溶质木糖还原酶(xylose reductase, XR)、β-D-葡萄糖苷酶(β-D-glucosidase, BGL)、木糖酶(xylosidase, XYL)和木聚糖酶(XYN)，显著提高木糖还原酶的活性。此外，Liang等[82]通过S. cerevisiae酵母表面展示技术同时展示2种木聚糖酶，获得较高酶活性，可作为诱导玉米防御反应的有力工具。 6 酵母展示技术在疫苗开发中的应用 酵母表面展示技术作为开发口服疫苗的工具，在人和动物传染性疾病预防中已经得到广泛应用。Lei等[83]基于酵母展示技术开发一种H7N9流感病毒口服疫苗，可对同源流感病毒提供有效的免疫保护作用。Shibasaki等[84]将白色念珠菌(Candida albicans)的烯醇化酶1 (enolase 1, Eno1p)展示在S. cerevisiae表面，成功制备一种新型的抗念珠菌感染的口服疫苗，接种疫苗的小鼠抗Eno1p抗体的滴度明显增加，表明酵母展示系统可能成为预防传染病的有力工具。Gao等[85]将SARS-CoV-2刺突蛋白RBD结构域展示在S. cerevisiae表面，作为候选疫苗，在小鼠中诱发强烈的免疫应答。Xing等[86]将SARS-CoV-2及其突变株B.1.1.7、B.1.351、B.1.617.1的刺突蛋白RBD融合到S. cerevisiae酵母Aga2锚定蛋白的C末端，接种口服疫苗的小鼠产生强烈的体液免疫和细胞免疫应答。研究发现，基于酵母展示技术开发口服疫苗可以实现低成本、快速、大规模制备有潜力的SARS-CoV-2候选疫苗。 疫苗在动物传染病的预防和控制中发挥着重要的作用。Le Linh等[87]在S. cerevisiae表面展示VP28抗原，将酵母细胞提取物与益生菌结合，获得针对白斑综合征病毒的口服疫苗，可用于预防虾口腔癌。传染性造血坏死病毒(infectious hematopoietic necrosis virus, IHNV)感染养殖虹鳟和各种鲑鱼[88]，利用改进的酵母表面展示技术制备一种预防IHNV的口服疫苗，虽然效果不及DNA疫苗，但作为候选疫苗可以保护鱼类免受IHNV的感染[89]。鲤疱疹病毒2型(cyprinid herpesvirus 2, CyHV-2)引起的疱疹病毒性造血坏死(herpesviral hematopoietic necrosis, HVHN)导致鲫鱼的急性群体性死亡，严重影响了鲫鱼养殖产业的发展[90]。Dong等[91]将CyHV-2的亚单位ORF25展示在S. cerevisiae细胞表面，制备出一种口服疫苗，可以引发黏膜和全身组织发生强烈的先天和适应性免疫应答，用于控制吉贝鲤鱼养殖中的CyHV-2感染；之后Wang等[92]在S. cerevisiae表面展示CyHV-2包膜蛋白ORF132，口服EBY100/pYD1-ORF132疫苗后，也能对鲫鱼感染CyHV-2提供保护。Zhang等[93]在S. cerevisiae表面展示大口黑鲈蛙虹彩病毒(largemouth bass ranavirus, LMBV)主衣壳蛋白(main capsid protein, MCP)，以大肠杆菌热敏肠毒素(Escherichia coli heat-labile enterotoxin, LTB)的B亚基作为佐剂，开发口服疫苗EBY100-OMCP和EBY100-LTB-OMCP，二者均能诱导大口黑鲈的全身免疫，且有效促进肠黏膜免疫的激活，使用LMBV感染时，疫苗接种组死亡率明显降低。 7 结论及展望 YSD是极有应用价值的一项技术，尤其是在生物技术领域，将异源蛋白表达在酵母表面，结合流式细胞分选，可以筛选出具有理想特性的蛋白质，已经广泛应用于抗体工程、酶工程、蛋白质工程和疫苗开发等领域。此外，荧光蛋白和酶已经被展示在酵母表面作为生物传感器[94]。Zhao等[95]将葡萄糖脱氢酶和胆固醇氧化酶表达在S. cerevisiae的表面，构建了全细胞生物传感器，用来检测葡萄糖和胆固醇。酵母表面展示系统的现有应用如此广泛，同时也在不断发展和完善，已经有研究开发出一个全新的酵母展示系统，仅使用Aga1p亚基，相比a-凝集素可以提高异源蛋白的展示效率[1]。而SpyTag/SpyCatcher系统可将展示效率提高到90%以上[65]。将来可能会有更多优良的酵母表面展示系统出现，为体外展示各种异源蛋白提供更多的选择。